Além dos anticorpos monoclonais (mAbs) e dos conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), fragmentos de anticorpos e seus conjugados com fármacos têm aplicações terapêuticas significativas. Esses fragmentos se ligam seletivamente a antígenos específicos, espelhando a função dos anticorpos intactos. Devido ao seu tamanho significativamente menor, os fragmentos de anticorpos requerem métodos analíticos dedicados para caracterização precisa e controle de qualidade.

Esta nota de aplicação apresenta um método preciso para separar um fragmento de cadeia variável única (scFv) de suas espécies conjugadas (FDC). A separação foi realizada utilizando um método SEC-MS. Para alcançar resolução e formas de pico ideais, é essencial um hardware de coluna bioinerte. Uma coluna YMC-Pack Diol-120 revestida com PEEK, livre de metal, foi selecionada para esta análise, garantindo alto desempenho na caracterização do scFv com peso molecular de aproximadamente 26 kDa.

A separação do scFv e FDC, injetados individualmente e como uma mistura, cada um em concentração de 0,5 mg/mL, sem isopropanol na fase móvel, já alcançou resolução suficiente. No entanto, a razão alvo FDC-para-scFv, baseada na área do pico, é de aproximadamente 0,8. Essa razão não é alcançada sob essas condições, seja para injeções individuais ou para a mistura.

A adição de 4,5% de isopropanol à fase móvel aumenta a área do pico do FDC hidrofóbico, permitindo que a razão de 0,8 seja alcançada em ambos os casos (Figura 1). Além disso, o isopropanol melhora a simetria do pico, aprimorando ainda mais o desempenho da separação.

Os espectros de massa desconvoluídos do scFv e FDC confirmam a separação de ambos os compostos, tornando este método uma ferramenta ideal para monitorar a conjugação do scFv.

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