A cromatografia por interação hidrofóbica é uma técnica de separação de proteínas através do uso de concentrações salinas específicas. Como são empregadas condições nas quais não ocorre a desnaturação de proteínas, sua conformação 3D e atividade biológica é mantida.1

O mecanismo por trás da separação corresponde a interações reversíveis entre o analito e o ligante hidrofóbico da fase estacionária ligado à superfície por meio da variação da concentração do gradiente salino.2

Em um ambiente aquoso, a superfície da fase estacionária e das proteínas que contêm frações hidrofílicas (em azul) e hidrofóbicas (em vermelho) ficam protegidas por uma camada de água ordenada (Figura 1A). Com a aplicação de altas concentrações de sais no começo do gradiente, essa ordenação das camadas de água nas vizinhanças da proteína e da fase estacionária é rompida, já que há uma maior preferência pelo processo de solvatação dos sais (Figura 1B). Como não há aumento de temperatura e entalpia, mas sim apenas de entropia, as interações hidrofóbicas são governadas por uma energia livre de Gibbs negativa.1

Figura 1. Proposta de retenção do mecanismo de separação por HIC.
(A) Em condições aquosas, camadas de água ordenada são formadas protegendo a superfície da proteína e da fase estacionária.
(B) Em altas concentrações de sal, as camadas de água ordenada são rompidas, expondo as superfícies hidrofóbicas.
Proteínas e ligantes de fase estacionária se associam por meio de interações hidrofóbicas impulsionadas pelo aumento da entropia.
(C) Interações hidrofóbicas enfraquecem gradualmente ao diminuir a força iônica da fase móvel e proteínas eluem sequencialmente de acordo com sua hidrofobicidade de superfície.

A escolha do sal é essencial, haja vista que suas características permitem obter diferentes seletividades. A série de Hofmeister fornece um modelo para a seleção do sal. Quanto maior sua característica liotrópica, maior a interação hidrofóbica entre o analito e a fase estacionária.2

Figura 2. Série Hofmeister de íons caotrópicos e liotrópicos.

Proteínas que apresentam características mais hidrofóbicas interagem mais fortemente com os ligantes da fase estacionária, logo, ficam mais tempo retidas. A redução da concentração salina do meio leva ao enfraquecimento gradual das interações hidrofóbicas, o que ocasiona o reordenamento das moléculas de água. Assim, os analitos eluirão em ordem crescente de hidrofobicidade da superfície (Figura 1C).1

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Referências:

•  Ewonde, R. E., Lingg, N., Eβer, D., Eeltink, S. A protocol for setting-up robust hydrophobic interaction chromatography targeting the analysis of intact proteins and monoclonal antibodies, Wiley.
• Nota técnica. YMC. Strategies to Improve Your HIC Analysis.