A crescente adoção de fármacos baseados em peptídeos e proteínas pela indústria biofarmacêutica tem se destacado nos últimos anos devido à sua elevada especificidade e seletividade em comparação com os fármacos tradicionais de pequenas moléculas. Entretanto, um ponto essencial durante a descoberta de fármacos é o seu processo de purificação de peptídeos/proteínas haja vista a necessidade de garantir a segurança e eficácia do produto, bem como para cumprir normas regulamentares.

O whey protein isolado, um subproduto da produção de queijo, contêm vários glicomacropeptídeos e dois peptídeos bioativos significativos: caseína macropeptídeo A (CMPa) e caseína macropeptídeo B (CMPb), com massas moleculares de 6757 Da e 6787 Da, respetivamente. A utilização de espectrometria de massas para a detecção desses bioativos oferece maior seletividade e sensibilidade em comparação aos detetores tradicionais como UV ou ELSD, que podem não responder eficientemente aos peptídeos e proteínas alvo.

Após o preparo da amostra, o extrato foi injetado no sistema AVANT® HPLC/CMS e o cromatograma obtido mostrou dois picos que, após identificados, indicaram ser dos macropeptídeos caseína A (CMPa – 6755 Da) e B (CMPb – 6787 Da). Em uma próxima etapa, o método analítico proposto e otimizado para a escala preparativa utilizou o sistema puriFlash® 5.250 prepLC acoplado online ao detector expression® CMS. A coleta das frações foi realizada com base no sinal de MS, utilizando a extração de íons específicos (XIC) para detectar seletivamente CMPa (m/z 965-966) e CMPb (m/z 970-971) – Figura 1.

Com esta abordagem, foi possível obter uma de pureza estimada de 86.7% com UV e 80% com MS (CMPb) e 94,7% (CMPa – UV) em frações isoladas, ao passo que para frações combinadas, obteve-se uma pureza em torno de 90%, considerado alto rendimento para a descoberta de moléculas bioativas. E o mais impressionante: pureza de até 99,0% pode ser obtida com frações seletivas.

Dessa forma, a análise por espectrometria de massas (MS) revelou ser mais específica do que a detecção por UV na determinação da pureza real de compostos bioativos. Exemplo disso é a pureza por UV de CMPb de 86,7%, mas a análise por MS indicou uma pureza estimada de 80% devido à detecção de componentes minoritários.

Este estudo de caso ilustra o valor da detecção por MS para compostos bioativos como peptídeos e proteínas, fornecendo maior confiança no processo de purificação. Quer saber mais sobre como o puriFlash® 5.250 e o expression® CMS podem impulsionar sua pesquisa e desenvolvimento de biofármacos?

👉 Acesse a aplicação completa para uma visão detalhada do método e dos resultados!