A preservação do estado nativo de biomoléculas, como imunoglobulinas (IgG) e conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), é essencial para análises precisas. A Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) permite essa separação em condições que mantêm sua integridade funcional, utilizando uma fase móvel com alta concentração de sal para promover a interação com a fase estacionária. A eluição ocorre à medida que a concentração de sal diminui, resultando na separação conforme a hidrofobicidade das moléculas.

Este estudo investiga como a otimização de parâmetros como pH, adição de solventes orgânicos, concentração de sal e taxas de mistura do gradiente podem aprimorar a separação por HIC na coluna TSKgel HIC-ADC Butyl, da Tosoh, parceira da Verde Analítica, elevando a eficiência na análise de ADCs e anticorpos monoclonais.

Resultados e Discussões

Modificação da Inclinação do Gradiente

A redução da concentração de sulfato de amônio (1 mol/L para 0 mol/L) ao longo de 15, 30 e 60 minutos afetou a eluição do anticorpo IgG1 (Amostra A). Gradientes mais suaves retardaram a eluição, pois a concentração crítica de sal foi atingida mais tarde (Figura 1).
Embora gradientes mais longos tenham melhorado a resolução entre o ombro e o pico principal, também resultaram em alargamento das bandas, reduzindo a sensibilidade. Assim, a inclinação ideal do gradiente deve equilibrar tempo de análise, separação e sensibilidade.

Influência da Concentração de Sal

Para avaliar o impacto na retenção e separação, foram testadas fases móveis com 1,0; 1,5 e 2,0 mol/L de sulfato de amônio no anticorpo IgG1 (Amostra A) (Figura 2). A concentração de sal foi reduzida linearmente até 0 mol/L em 30 minutos, resultando em um gradiente mais íngreme para concentrações iniciais mais altas.

Separações iniciadas com 1 mol/L de sulfato de amônio resultam em tempos de retenção mais curtos e melhor separação entre o ombro e o pico principal do mAb, em comparação com concentrações iniciais mais altas de sal. Embora a separação melhore com concentrações menores de sal, aumentos na concentração de sal na fase móvel inicial elevam a altura dos picos, melhorando a sensibilidade, um efeito semelhante ao de um gradiente mais íngreme (Figura 1).

Modificação do pH

O pH da fase móvel influencia a carga superficial das proteínas e anticorpos próximos ao seu ponto isoelétrico, alterando a distribuição de variantes carregadas em solução. No caso dos conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), essas variações podem ser ainda mais acentuadas devido a interações intramoleculares causadas pelos fármacos conjugados. Como resultado, as variantes de ADC com diferentes hidrofobicidades podem ser separadas por HIC.
O Drug-to-Antibody Ratio (DAR) representa a razão entre o número de moléculas de fármaco ligadas a um único anticorpo em um ADC. Esse parâmetro é fundamental para caracterizar a heterogeneidade dessas biomoléculas, influenciando sua hidrofobicidade, estabilidade e eficácia terapêutica.
A influência do pH na separação de um ADC mimético (Amostra B) foi avaliada com fases móveis tamponadas entre pH 5 e 7. Em pH 5, as variantes de baixo DAR (DAR = 0, 2 e 4) eluíram mais cedo, enquanto os picos de alto DAR (DAR = 6 e 8) apresentaram alargamento de banda e menor sensibilidade. Com o aumento do pH, a eficiência cromatográfica melhorou, resultando em picos mais definidos. Próximo ao pI do ADC mimético (~7), a molécula se torna menos carregada e mais hidrofóbica, levando a um aumento na retenção (Figura 3).

Uso de Solvente Orgânico na Separação por HIC

A coluna TSKgel HIC-ADC Butyl possui alta densidade de ligantes, otimizando a separação de isoformas de ADC com diferentes razões DAR. A adição de solventes orgânicos pode modificar as interações hidrofóbicas entre os analitos e a fase estacionária, influenciando diretamente a separação por HIC.
Para avaliar esse efeito, foram realizados experimentos de HPLC com diferentes concentrações de isopropanol (IPA) na fase móvel forte (0 %, 10 % e 20 % v/v) (Figura 4). A presença de IPA acelerou e completou a eluição das variantes de alto DAR (DAR = 6 e 8), que, na ausência do solvente, não foram eluídas. Em concentrações mais altas de isopropanol, essas variantes apresentaram picos bem definidos. Por outro lado, baixas concentrações de IPA resultaram no alargamento de banda das variantes mais hidrofílicas e na eluição parcial das espécies DAR.

A eluição completa e antecipada na presença de 20% de isopropanol (IPA) ocorre porque o solvente reduz as interações hidrofóbicas entre a fase estacionária e as variantes de DAR retidas na coluna. Embora a retenção na HIC seja baseada principalmente em interações hidrofóbicas, a combinação de moléculas altamente hidrofóbicas com uma fase estacionária de elevada hidrofobicidade pode resultar em uma retenção excessiva, impedindo a eluição dos analitos. Como demonstrado, a adição de uma pequena quantidade de solvente orgânico à fase móvel é uma estratégia eficaz para melhorar a eluição e evitar esse comportamento.

Conclusão

Essa aplicação demonstrou a separação eficiente de moléculas com diferentes hidrofobicidades, como ADCs e anticorpos monoclonais, utilizando a coluna TSKgel HIC-ADC Butyl. Ajustando as condições da fase móvel, foi possível otimizar os parâmetros de separação para melhores resultados.
Fatores como pH, composição do solvente orgânico, concentração de sal e taxas de mistura do gradiente influenciam significativamente a Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC). Compreender a interação dessas variáveis permite a otimização sistemática dos métodos de HIC, tornando as separações mais eficazes e reprodutíveis.

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