A descoberta de novos ligantes para alvos farmacológicos depende, em grande parte, da capacidade de identificar interações específicas entre moléculas e proteínas. Métodos tradicionais de triagem muitas vezes exigem processos longos de purificação e isolamento, especialmente quando se trabalha com extratos naturais complexos. Nesse cenário, técnicas de seleção de afinidade acopladas à espectrometria de massa (AS-MS) surgem como ferramentas valiosas, permitindo detectar ligantes de forma rápida, seletiva e sem a necessidade de marcações adicionais.

Entre as abordagens AS-MS, a cromatografia de exclusão por tamanho acoplada à espectrometria de massa (SEC-AS-MS) se destaca por sua simplicidade e automação. Nesse método, uma mistura de compostos é incubada com o receptor de interesse até atingir o equilíbrio. Os complexos ligante-receptor, por serem maiores que os ligantes livres, são separados por SEC, também conhecida como cromatografia de permeação em gel, que discrimina moléculas com base no tamanho. Em seguida, os ligantes são liberados do receptor por desnaturação química ou mudança de pH, e identificados por LC-MS ou UHPLC-MS. Além de separar os ligantes entre si e do receptor, a etapa de fase reversa remove tampões de ligação que poderiam interferir na espectrometria de massa. A SEC-AS-MS pode ser realizada em temperaturas reduzidas para evitar a dissociação dos complexos e maximizar a sensibilidade.

A figura abaixo ilustra esse processo passo a passo. Primeiro, os ligantes presentes no extrato interagem com o receptor, formando os complexos ligante-receptor (etapa Binding). Em seguida, a cromatografia de exclusão por tamanho (Size Exclusion Chromatography) separa os complexos maiores das moléculas não ligantes. Na etapa de fase reversa (Reversed-Phase LC), os ligantes são liberados dos receptores e separados entre si, enquanto os tampões de ligação são removidos. Por fim, os ligantes são identificados por UHPLC-MS ou MS/MS (Analysis and Identification), revelando quais moléculas apresentam afinidade pelo alvo farmacológico estudado.

Figura 1: Esquema simplificado da metodologia SEC-AS-MS. A mistura contendo extrato e receptor passa por três etapas principais: (1) formação dos complexos ligante-receptor (Binding), (2) separação por tamanho via cromatografia de exclusão (Size Exclusion Chromatography), (3) liberação e separação dos ligantes na fase reversa (Reversed-Phase LC), seguida da identificação por espectrometria de massa (Analysis and Identification).

Essa abordagem tem sido amplamente aplicada na triagem de bibliotecas combinatórias e, cada vez mais, em produtos naturais, permitindo identificar rapidamente compostos bioativos em extratos botânicos complexos.

No post de hoje, trazemos uma aplicação da SEC-MS para investigar ligantes dos receptores PPARα e PPARγ em extratos de Allium lusitanicum, com destaque para as saponinas como potenciais moléculas de interesse. Para essa separação, utilizou-se a coluna TSK Gel Super SW2000 (300 x 4,6 mm ID, 4 μm) da Tosoh Bioscience (faixa operacional 1–150 kDa), que permitiu isolar de forma eficiente os complexos ligante-receptor dos compostos livres, graças à sua alta resolução e reprodutibilidade.

A Figura 2a mostra o cromatograma do LBD de PPARγ incubado com rosiglitazona, um ligante já conhecido, para validar o método e definir a janela de eluição dos complexos (8,5–10,5 min). Já a Figura 2b apresenta o cromatograma do mesmo receptor incubado com o extrato metanólico de Allium lusitanicum, destacando como a mesma janela de eluição pode ser usada para identificar potenciais novos ligantes presentes na mistura complexa do extrato vegetal.

Figura 2: Perfis cromatográficos obtidos por SEC-UV para PPARγ (10 μM) incubado com a) rosiglitazona (50 nM) e b) extrato de Allium lusitanicum, evidenciando a separação dos complexos ligante-receptor das moléculas livres.

Essa separação clara entre as proteínas-alvo (~33 kDa) e as pequenas moléculas foi essencial para o sucesso da etapa seguinte, que envolveu a identificação dos ligantes por MS. Esses resultados demonstram não apenas o potencial da SEC-AS-MS para acelerar a descoberta de novos ligantes, mas também a excelente performance da coluna TSK Gel Super SW2000, disponível no Brasil pela Verde Analítica.

Para entender em detalhes como a técnica de SEC-AS-MS pode ser aplicada na investigação da afinidade entre ligantes em extratos naturais, recomendamos a leitura completa deste artigo.

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