Os anticorpos monoclonais (mAbs) são uma classe essencial de biofármacos com aplicações terapêuticas amplas e de grande impacto clínico. Assim como outras proteínas, eles são suscetíveis a modificações químicas e enzimáticas durante a fabricação, formulação e armazenamento. Essas alterações podem gerar micro-heterogeneidades que precisam ser cuidadosamente monitoradas, pois diferenças em impurezas ou produtos de degradação podem comprometer a segurança e eficácia do medicamento. Entre as modificações mais comuns estão a desaminação, a oxidação de metionina, o truncamento de lisina e a glicosilação, todas capazes de alterar o perfil de carga da molécula [1].

Tradicionalmente, a cromatografia de troca catiônica acoplada à espectrometria de massas (CEX-MS) é a técnica preferida para caracterizar a heterogeneidade de carga da maioria dos mAbs comerciais, principalmente aqueles baseados em IgG1, que apresentam ponto isoelétrico (pI) elevado. No entanto, essa abordagem se mostra menos adequada para mAbs baseados em IgG4, que possuem pI mais baixos e comportamento cromatográfico distinto. Diante dessa limitação, pesquisadores desenvolveram e aplicaram um método alternativo utilizando cromatografia de troca aniônica acoplada à espectrometria de massas (AEX-MS) para a análise de variantes de carga em mAbs IgG4.

O estudo empregou a coluna BioPro IEX QF (5 µm, 100 x 4.6 mm) da YMC, uma fase estacionária de troca aniônica forte (SAX) especialmente projetada para oferecer alta resolução e excelente estabilidade em gradientes de sal. A configuração do sistema incluiu um divisor de fluxo que direcionava parte do efluente para o detector UV e uma fração submicrolitro para a espectrometria de massas, utilizando ionização por nanoeletrospray (NSI-MS), técnica capaz de tolerar concentrações elevadas de acetato de amônio.

Os resultados demonstraram que o método AEX-MS foi altamente eficaz para mAbs IgG4 com pIs entre 6,1 e 7,3, apresentando separações mais nítidas à medida que o pI diminuía. Em comparação direta com o CEX-MS, o AEX-MS ofereceu desempenho superior na separação de variantes de carga, identificando tanto variantes ácidas, relacionadas à desaminação, glicação e presença de ácido siálico, quanto variantes básicas, associadas à lisina C-terminal não processada e diferenças na N-glicosilação da região Fc.

A coluna BioPro IEX QF mostrou excelente desempenho em resolução e reprodutibilidade, revelando-se particularmente sensível às diferenças de glicosilação e permitindo a separação de produtos de desaminação sítio-específicos, inclusive no nível de subunidades Fc. Além disso, a análise de amostras deglicosiladas evidenciou melhora significativa na nitidez dos picos e na separação geral, reforçando a robustez da metodologia.

A coluna BioPro IEX QF foi desenvolvida com um leito composto por partículas rígidas de material polimérico não poroso, o que proporciona alta eficiência e excelente resolução na separação de proteínas e outras biomoléculas carregadas. Essa estrutura rígida evita a compressão do leito, garantindo desempenho consistente mesmo sob altas pressões e possibilitando o desenvolvimento de métodos rápidos e reprodutíveis. Além disso, ao respeitar a capacidade de carregamento do leito, é possível obter separações altamente eficientes, com picos bem definidos e recuperação superior das amostras — tornando a BioPro IEX QF uma escolha ideal tanto para análises de desenvolvimento quanto para controle de qualidade.

Esses resultados destacam o potencial da tecnologia da YMC para atender aos desafios analíticos dos mAbs IgG4, oferecendo uma abordagem alternativa de alta resolução para o monitoramento da heterogeneidade de carga e dos atributos críticos de qualidade (CQAs) desses biofármacos. O método AEX-MS, aliado à performance da coluna BioPro IEX QF, se consolida como uma ferramenta poderosa para caracterização precisa, eficiente e compatível com as exigências regulatórias do desenvolvimento biofarmacêutico moderno.

Baixe o Application Note completo clicando no botão abaixo e conheça todos os detalhes do método AEX-MS!

Referências Bibliográficas

[1] FEKETE, S.; BECK, A.; GUILLARME, D. Characterization of cation exchanger stationary phases applied for the separations of therapeutic monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 111 (2015) 169–176.