Oligonucleotídeos são pequenas sequências sintéticas de nucleotídeos que desempenham um papel fundamental em pesquisas biomoleculares, desenvolvimento de terapias gênicas, siRNA, aptâmeros e diagnóstico molecular. Devido à sua importância biológica e farmacêutica, é essencial garantir a pureza e a integridade dessas moléculas, uma vez que pequenas variações em sua sequência ou estrutura podem afetar significativamente sua atividade biológica. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma ferramenta essencial para essa análise, permitindo separar oligonucleotídeos com base em tamanho, carga e modificações químicas, assegurando que cada molécula seja caracterizada com precisão, e garantindo controle de qualidade confiável para aplicações de pesquisa e industriais.

A análise dos oligonucleotídeos do padrão Mix 12-33 NT da Supelco foi realizada utilizando a coluna YMC Accura BioPro IEX QF, uma coluna de troca aniônica forte projetada para oferecer alta eficiência e seletividade na separação de moléculas carregadas, como DNA sintético. Essa coluna combina partículas de 3 μm com um comprimento compacto de 30 mm, permitindo separações rápidas sem comprometer a resolução. Durante a análise, foram empregadas condições cromatográficas otimizadas com fase móvel composta por 10 mM HEPES a pH 8 como solvente A e 10 mM HEPES com 1 M NaClO4 como solvente B, aplicando um gradiente rápido de 20 a 100 %B em 2,5 minutos, seguido de 100 %B até 3,5 minutos, a uma temperatura elevada de 70 °C e fluxo de 0,5 mL/min.

O resultado foi uma separação extremamente rápida, realizada em menos de dois minutos, na qual os oligonucleotídeos eluíram de acordo com sua carga total e comprimento. O Oligo-1, composto por 12 timinas, e o Oligo-2, com a mesma sequência modificada na extremidade 3’ com biotina, apresentaram as menores retenções e eluíram primeiro, refletindo sua menor carga total. Em seguida, o Oligo-6, uma sequência repetitiva de 15 nucleotídeos T/C, exibiu retenção intermediária, enquanto os oligonucleotídeos de comprimento maior, como o Oligo-3 (25 nucleotídeos) e o Oligo-5 (20 nucleotídeos), mostraram eluições subsequentes, devido à maior quantidade de grupos fosfato interagindo com a fase estacionária carregada positivamente. Por fim, o Oligo-4, o mais longo com 33 nucleotídeos, apresentou a maior retenção, eluindo por último.

Essa análise demonstra a capacidade da coluna YMC Accura BioPro IEX QF de separar oligonucleotídeos com diferentes tamanhos e modificações em tempo extremamente curto, garantindo picos bem definidos e reprodutibilidade consistente, mesmo em condições de gradiente acelerado.

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