Durante a fabricação e o armazenamento de biofármacos, é comum a formação de variantes com propriedades distintas das desejadas, geradas por reações enzimáticas ou interações físico-químicas. A caracterização dessas variantes é essencial para garantir a eficácia e segurança dos produtos farmacêuticos. Dentre essas variantes, destacam-se os anticorpos monoclonais (mAbs) oxidados, cujas alterações podem impactar diretamente sua atividade biológica e estabilidade. A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é uma técnica amplamente utilizada para a análise dessas variantes, permitindo uma separação precisa das espécies oxidadas.

A YMC, parceira da Verde Analítica, desenvolveu a coluna BioPro HIC BF, especialmente projetada para a separação de proteínas de baixa hidrofobicidade, como os mAbs oxidados. A BioPro HIC BF utiliza uma fase estacionária de polímero hidrofílico não poroso modificado com grupos butila (C4), conferindo-lhe uma maior capacidade de interação hidrofóbica. Isso resulta em uma retenção mais eficaz das proteínas, permitindo a separação das variantes oxidadas com alta precisão.

Nesta aplicação, demonstramos o desempenho da coluna BioPro HIC BF ao utilizar o hidroperóxido de tert-butila (t-BHP) como agente oxidante para promover a oxidação de resíduos de metionina no mAb NIST. Sob as condições cromatográficas da figura abaixo, observa-se que a coluna BioPro HIC BF foi capaz de separar de maneira eficaz o mAb oxidado do mAb não oxidado, utilizando uma vazão baixa e um gradiente suave.

No cromatograma (a), os quatro picos que eluíram mais cedo foram identificados como derivados de espécies que apresentaram resíduos de metionina oxidados no mAb. A oxidação de resíduos de metionina, que pode ocorrer pela formação de cadeias laterais de sulfeto, resulta em mudanças conformacionais que impactam a estrutura da proteína. Ao utilizar cloreto de sódio em vez de sulfato de amônio, uma resolução superior foi obtida, com um tempo de análise reduzido (b). Essas variantes oxidadas de mAbs eluem em tempos anteriores ao pico do mAb não oxidado, facilitando sua identificação e caracterização.

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Referência Bibliográfica: MO, Jingjie; YAN, Qingrong; SO, Chi Kwong; SODEN, Tam; LEWIS, Michael J.; HU, Ping. Understanding the Impact of Methionine Oxidation on the Biological Functions of IgG1 Antibodies Using Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, [S. l.], v. 88, p. 9495–9503, 2016. DOI: 10.1021/acs.analchem.6b01958.